数据案例展示

 

构建一个包含靶向人全基因组的sgRNA文库，文库包含63950 条sgRNA序列。文库构建完成后Sanger及NGS检测文库错误率，覆盖度及均一性。

 

 

文库错误率低

 

选取一个批次构建完成后随机抽取30个克隆进行桑格测序。测序结果表明在随机挑选的克隆中，100%的sgRNA序列和理论序列完全一致。

 

图1. 桑格测序结果

 

 

覆盖率高、分布均一，批次间稳定性高

 

文库的覆盖度和分布均一性是评价文库质量的重要指标，使用NGS方法进行验证。覆盖率是指构建文库中包含目标序列的比例。理想状态下文库中不同sgRNA是均匀分布的，但因PCR过程及克隆过程会有一定的偏好性，导致一部分sgRNA reads数较低，一部分sgRNA reads数较高，因此使用均一性评价文库中序列分布的均匀程度，通常采用分布斜率Skew Ratio评价，通常认为数值<10代表为合格文库，数值越小代表均一性越好。

 

 

四个批次构建文库数据分析结果如下：

 

批次	理论gRNA多样性	实际gRNA多样性	覆盖度 （实际sgRNA多样性/理论多样性）	Skew Ratio
01	63950	63950	100%	2.24
02	63950	63940	99.98%	2.39
03	63950	63937	99.98%	2.91
04	63950	63943	99.99%	2.29