CRISPR sgRNA文库：基因编辑的革命性工具

        CRISPR-Cas9系统自问世以来，已成为生物医学研究中最为强大的基因编辑工具之一。其中，sgRNA（单导向RNA）文库的构建是实现高通量基因功能研究和筛选的关键技术。本文将探讨sgRNA文库的构建过程及其在现代生物学中的应用。

 

sgRNA文库

        sgRNA文库由成千上万个不同的sgRNA组成，每个sgRNA都针对基因组中的特定位置。这些文库使得研究人员能够同时敲除或敲入多个基因，从而快速评估基因功能和基因间的相互作用。

 

sgRNA文库的构建

       sgRNA文库的构建是一个涉及分子生物学、生物信息学和高通量合成技术的复杂过程，构建sgRNA文库涉及多个关键步骤和考量因素：

1. 目标基因选择与验证

- 目标基因列表：首先，研究人员需要根据研究目的确定一个或多个目标基因列表。这些基因可能与特定的生物学过程、疾病状态或治疗响应相关。

- 基因位置：确定基因的确切位置，包括外显子、启动子或其他调控区域，以便设计靶向这些区域的sgRNA。

2. sgRNA设计

- 设计原则：设计sgRNA时，需要遵循特定的规则，以确保它们能够有效地结合到目标DNA序列并被Cas9酶识别。通常，sgRNA由约20个碱基的靶向序列和通用的支架序列组成。

- 在线工具：可以使用多种在线工具和数据库来预测sgRNA的靶向效率、特异性和潜在的脱靶效应。

- 避免脱靶：设计时需尽量避免可能引起非特异性结合的序列，以减少脱靶效应。

3. 寡核苷酸合成

- 高通量合成：利用44118太阳成城集团的DYHOW平台等高通量DNA合成技术，可以一次性合成CRISPR sgRNA定制文库。

- 纯度与质量：合成过程中需要严格控制寡核苷酸的纯度和质量，以确保后续实验的成功。

- 成本效益：高通量合成平台可以显著降低单个sgRNA的成本，使得大规模文库构建成为可能。

4. 文库验证

- 测序验证：通过下一代测序（NGS）技术，可以验证文库中每个sgRNA的存在、丰度和准确性。

- 覆盖度和均一性：确保文库具有高覆盖度和均一性，意味着每个sgRNA都能被均匀地代表，没有某个或某些sgRNA过度表达或缺失。

- 批次间一致性：如果文库需要大规模生产，批次间一致性也是一个重要的考量因素，以确保不同批次的文库具有可比性。

5. 文库应用

- 文库构建：将合成的sgRNA寡核苷酸克隆到表达载体中，构建稳定的sgRNA文库。

- 转染或转化：将文库转入细胞或生物体中，进行基因编辑实验。

- 功能性测试：通过分子生物学实验（如西方印迹、PCR、RNA-seq等）验证sgRNA的功能，确保它们能够诱导预期的基因编辑事件。

6. 数据分析

- 生物信息学分析：收集编辑后的细胞或生物体的数据，使用生物信息学工具分析基因编辑的结果。

- 基因功能推断：根据编辑结果推断基因功能，识别关键基因和新的生物学途径。

 

太阳集团sgRNA文库合成案例

       我们构建了一个包含靶向人全基因组的sgRNA文库，文库包含63950 条sgRNA序列。文库构建完成后Sanger及NGS检测文库错误率，覆盖度及均一性。

文库错误率检测

       选取一个批次构建完成后随机抽取30个克隆进行桑格测序。

图2.桑格测序结果

       测序结果表明在随机挑选的克隆中，100%的sgRNA序列和理论序列完全一致。

 

覆盖度、均一性和批间稳定检测

       文库的覆盖度和分布均一性是评价文库质量的重要指标，使用NGS方法进行验证。覆盖率是指构建文库中包含目标序列的比例。理想状态下文库中不同sgRNA是均匀分布的，但因PCR过程及克隆过程会有一定的偏好性，导致一部分sgRNA reads数较低，一部分sgRNA reads数较高，因此使用均一性评价文库中序列分布的均匀程度，通常采用分布斜率Skew Ratio评价，通常认为数值<10代表为合格文库，数值越小代表均一性越好。

       四个批次构建文库数据分析结果如下：

批次	理论gRNA多样性	实际gRNA多样性	覆盖度 （实际sgRNA多样性/理论多样性）	Skew Ratio
01	63950	63950	100%	2.24
02	63950	63940	99.98%	2.39
03	63950	63937	99.98%	2.91
04	63950	63943	99.99%	2.29

 

 

 

        结果显示，太阳集团构建的sgRNA文库的覆盖率高、分布均一，批次间稳定性高。

 

sgRNA文库的应用

1. 基因功能研究

- 全基因组筛选：sgRNA文库可以用于全基因组范围内的筛选，以鉴定特定生物学过程或疾病相关的关键基因。

- 功能基因组学：通过敲除不同的基因，研究人员可以研究基因在细胞生长、分化、凋亡等过程中的作用。

- 信号通路分析：sgRNA文库有助于揭示基因如何通过信号通路相互影响，以及它们在疾病中的作用。

2. 药物靶点筛选和验证

- 药物响应基因鉴定：通过比较药物处理前后的基因敲除细胞，可以鉴定影响药物响应的关键基因。

- 药物组合效应研究：sgRNA文库可以用于研究不同药物组合对细胞的影响，以及它们如何影响特定基因的表达。

3. 疾病模型构建

- 遗传性疾病研究：sgRNA文库可以用来敲除与遗传性疾病相关的基因，构建疾病模型，以研究疾病机理和开发治疗方法。

- 肿瘤学研究：在癌症研究中，sgRNA文库可以用来敲除肿瘤抑制基因或癌基因，以研究它们的致癌作用和肿瘤发展。

4. 基因相互作用网络分析

- 基因网络构建：通过同时敲除多个基因，研究人员可以构建基因相互作用网络，理解基因如何在细胞内协同工作。

- 表型关联分析：sgRNA文库可以用来研究基因变异与特定表型之间的关联，这对于理解复杂疾病的遗传基础至关重要。

5. 基因治疗策略开发

- 治疗基因的发现：sgRNA文库可以帮助识别可以作为治疗靶点的基因，为开发新的基因治疗策略提供线索。

- 基因编辑技术的优化：通过测试不同的sgRNA，研究人员可以优化CRISPR-Cas9系统的效率和特异性，减少脱靶效应。

6. 农业生物技术

- 作物改良：sgRNA文库可以用于敲除作物中的不利基因，如抗病性、抗旱性或营养价值相关的基因，以改良作物品种。

- 基因功能鉴定：在植物中，sgRNA文库可以用来鉴定控制重要农艺性状的基因，如产量、品质和抗逆性。

7. 合成生物学

- 基因回路设计：sgRNA文库可以用于合成生物学中基因回路的设计和测试，通过精确控制基因表达来构建复杂的生物系统。

- 生物制造：在生物制造领域，sgRNA文库可以用来优化微生物的生产途径，提高生物燃料和化学品的产量。

8. 环境科学

- 微生物群落研究：sgRNA文库可以用于研究环境样本中的微生物群落，通过敲除特定基因来理解它们在生态系统中的角色。

- 污染物降解基因研究：通过敲除与污染物降解相关的基因，研究人员可以鉴定和优化用于生物修复的关键基因。

 

总结

        CRISPR sgRNA文库是现代基因编辑技术中不可或缺的工具，它极大地加速了基因功能研究和药物开发进程。随着合成生物学和基因编辑技术的不断进步，sgRNA文库的应用前景将更加广阔。

        如需了解更多关于sgRNA文库的信息，请访问CRISPR sgRNA 定制文库| 定制 sgRNA 文库合成 - 44118太阳成城集团 (dynegene.com)。